产品货号:
YT882
中文名称:
蛋白G琼脂糖
英文名称:
Protein G Agarose(Fast Flow)
产品规格:
2ml
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品主要用于免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP),也可以用于抗体的纯化。适合于免疫沉淀mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c,rabbit、goat polyclonal Abs,human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
Protein G共价交联到4% agarose beads (Fast Flow)上,2mL Protein G Agarose中共含有约2mg重组的Protein G。2mL Protein G Agarose共可以结合约11mg human IgG。推荐的线性流速为50-300cm/h。本Protein G Agarose配制在TBS溶液中,2mL中共含有0.5mL Agarose beads。
组分 | 规格 |
Protein G Agarose | 2×1mL |
说明书 | 1份 |
保存:4℃,有效期一年。
本Protein G Agarose如果用于常规的免疫沉淀,可以免疫沉淀100次。
- 请勿冷冻保存本制品。
- Protein G Agarose使用前一定要充分重悬,即充分颠倒若干次使混合均匀。
- 从蛋白样品收集开始,所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
- 本制品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 免疫沉淀(IP):
- 蛋白样品的准备:
- 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500μL至2mL细胞裂解液裂解细胞。可以使用百奥莱博的Western及IP细胞裂解液(YT038)或各种RIPA裂解液(YT609、YT610、YT611或YT612)等进行细胞的裂解。
- 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
- 对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
- 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
- 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500μL至2mL细胞裂解液裂解细胞。可以使用百奥莱博的Western及IP细胞裂解液(YT038)或各种RIPA裂解液(YT609、YT610、YT611或YT612)等进行细胞的裂解。
- 去除非特异性结合(可选做):
- 取200μL至1mL蛋白样品,蛋白量约为200μg至1mg,加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20μL充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
- 2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。
- 所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。
- 取200μL至1mL蛋白样品,蛋白量约为200μg至1mg,加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20μL充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
- 免疫沉淀:
- 加入0.2~2μg用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。
- 再加入20μL充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动1~3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40μL。)
- 2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。
- 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5~1mL。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3.c。
- 完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20~40μL 1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。
- 100℃或沸水浴处理3~5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。
- 加入0.2~2μg用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。
- 蛋白样品的准备:
- 免疫共沉淀:
参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。 - 抗体纯化:
- 准备工作:
- 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
- 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
- 选择适当的纯化柱,用适当量的Protein G Agarose装填纯化柱。
- 用10~20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱,流速可以用恒流泵控制为1mL/min。如无恒流泵,也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。
- 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
- 抗体纯化:
- 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
- 待纯化的抗体过柱后,用10~20倍柱体积的TBS洗涤,以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
- 洗涤完后,用10mL 50mM glycine,pH2.7作为洗脱液,洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein G的结合能力很强,在pH2.7时洗脱效果不太理想,可以使用50mM glycine,pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体,根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
- 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
- 纯化柱的再生:
- 用10~20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱,使纯化柱达到中性的pH。
- 用TBS来保存再生的纯化柱。
- 用10~20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱,使纯化柱达到中性的pH。
- 准备工作:
相关搜索:蛋白G琼脂糖,Protein G,蛋白G,琼脂糖,免疫沉淀,免疫共沉淀,抗体纯化,Protein G Agarose(Fast Flow)